微生物与人类生活息息相关，除了在环境中遇到各类微生物之外，我们的身体也离不开微生物。据统计，成人肠道含有100万亿微生物，其基因数是人基因数的100倍，总重量在1.5 kg左右(Jesse D, 2013)。

因此，K Ray曾诙谐地表明，“我们更像是微生物而不是人，我们与肠道菌群之间并非朋友关系而是更亲近—我们已经‘嫁给’它们”（K Ray, 2012）。

既然“嫁给”了微生物，我们就要对微生物有充分的了解，宏基因组技术则是了解微生物群落结构和功能的利器。

随着基因组测序成本的降低，更多的专家学者倾向于通过大数据来分析物种多样性、功能基因、构建代谢通路等。然而现在，利用宏基因组大数据量却可以完成传统技术无法解决的问题，即Contig Binning的分析方法解析那些无法纯培养微生物的基因组。

Contig Binning是基于宏基因组测序序列，将组成相似或丰度一致的Contigs聚类到同一物种从而完成单菌的草图组装，再利用常规的生物信息分析的方法解析基因组的功能。因此，对于那些难以培养的微生物，利用Contig Binning的生物分析方法可获得它们的基因组草图。

以下是近几年发表的用Contig Binning的分析方法组装难培养微生物的文章，可供大家参考：

既然Contig Binning的分析策略可以完成难培养的微生物基因组草图，那它的研究思路究竟如何？事实上，无论是环境微生物还是人体微生物，都可以通过Contig Binning的方法进行研究，并得到高质量的微生物基因组。

早在2012年就有专家学者针对肠道微生态样本进行了Contig Binning组装，并获得了高质量的微生物基因组。Mads曾在《Nature Biotechnology》发表了一篇题为《Genome sequences of rare, uncultured bacteria obtained by differentialcoverage binning of multiple metagenomes》的文章，并呈现了Contig Binning的组装思路：

Step1：样品准备

Step2：两种不同的方法提取DNA（热酚提取与非热酚提取），因此不同的微生物组分会有不同的相对丰度

Step3：PE 150测序（HP+和HP-分别获得29G和57G高质量测序数据）

Step4：宏基因组组装，得到非冗余的scaffolds序列

Step5-8：计算两种提取方法中每个scaffolds的丰度，并进行均一化处理；同时计算Teltranucleotide频率、GC含量、是否是保守的单拷贝标记基因（如16S rDNA序列）作为序列聚类的参考标准

Step9：以两种提取方法获得的scaffolds丰度构建坐标系，依据scaffolds的丰度进行Contig Binning聚类，Contig Binning的集合就代表了假定的某一微生物群落的基因组，其中圆圈的大小代表序列的长度，不同颜色代表单拷贝基因。由于不同的物种可能会有同一丰度的基因集合，因此Contig Binning的聚类结果还需进行Teltranucleotide频率的主成分分析，以区分不同物种

Step10：从测序数据中筛选重复元件或多拷贝基因

Step11-12：筛选所有的与Contig Binning聚类集合相关的reads，重新进行基因组de novo组装，获得一个标准的基因组草图。可根据保守的单拷贝基因对组装结果进行验证，明确组装或其他的基因组结构问题，并通过Cytoscape对重复序列和微生物多样性代表序列进行可视化

作者通过Contig Binning的分析方法，最终获得了31个细菌基因组，包括相对丰度在1%以下的物种基因组，并对31个细菌物种进行了门水平的分类。

        同样，Mohamed利用宏基因组数据，研究了红海海域8个位置的微生物群落，通过Contig Binning的序列聚类和分析，获得了136个微生物基因组(Mohamed et al., 2016)。与Mads稍有不同的是，Mohamed主要将Teltranucleotide和序列相对丰度作为Contig Binning的聚类的参考指标，具体的分析策略如下：

对组装获得的136个微生物基因组，Mohamed分别进行了古菌和细菌的分类分析。对于古菌而言，作者依据122个单拷贝标记基因构建物种进化树；对于细菌而言，作者依据120个单拷贝标记基因进行物种分类分析，结果如下：

由于Contig Binning的组装策略可以帮助科研工作者探索样品中难以培养的微生物群落，因此自从Contig Binning的组装策略问世以来，很多专家学者都陆陆续续对Contig Binning的组装方法展开了研究。
Microbiome期刊于2016年发表了一篇综述，认为Contig Binning的组装策略主要分为3类：核酸组成（NC）、核酸组成与丰度（NCA）、积分丰度（DA）等，然而各个方法都有各自的优缺点(Naseer Sangwan, 2016)。将核酸的组成与序列的丰度相结合被认为是一种比较好的策略，既能保证Contigs Binning的效果，也能相对节约计算资源。具体信息如下表所示：

        另外，这篇综述还汇总了用于Contig Binning组装的软件及其功能介绍，其中MetaBAT就是Mohamed在《A catalogue of 136 microbial draftgenomes from Red Sea metagenomes》中使用的Contig Binning组装软件：

        同样的，该篇综述对Contig Binning的整体思路做了总结。细细品味，该篇综述所总结的思路其实与Mads在《Genome sequences of rare, unculturedbacteria obtained by differential coverage binning of multiple metagenomes》文章中所提倡的思路有不谋而合之处。两种思路都提倡依据序列丰度和核苷酸组分分析（核苷酸频率、GC含量、必要的单拷贝基因）来进行Contig Binning的基因组组装。具体思路可参考下图：

需要值得注意的是，对于不同的研究，或者依据不同的样本量的大小，或者对于不同的样本类型，选择Contig Binning的组装策略都会有细微的差异。因此，我们在选择Contig Binning来组装无法培养的微生物基因组时也需谨慎。
参考文献：
[1] Jesse D. Aitken and Andrew T. Gewirt. Toward understanding and manipulating the microbiome to   treat intestinal disease. 2013
[2] K Ray .Gut microbiota: married to our gut microbiota. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 2012
[3] Mads Albertsen et al. Genome sequences of rare, uncultured bacteria obtained by differential coverage binning of multiple metagenomes. Nature Biotechnology, 2012
[4] Mohamed et al. A catalogue of 136 microbial draft genomes from Red Sea metagenomes. Scientific Data, 2016
[5] Naseer Sangwan. Recovering complete and draft population genomes from metagenome datasets. Microbiome, 2016

(本文转载自小木虫)